北京科學(xué)與類腦研究中心（CIBR）熊巍實(shí)驗(yàn)室在 Cell子刊 Cell  Reports發(fā)表的題目是：在人類DFNB23非綜合征性耳聾模型p  CDH15AV-3J小鼠中的模板非依賴性基因組編輯（應(yīng)用于人類非綜合征性耳聾DFNB23動(dòng)物模型Pcdh15av-3j小鼠品系的不依賴修復(fù)模板的基因編輯）。

首次在哺乳動(dòng)物模型上展示了利用非同源末端連接的基因修復(fù)通路有效實(shí)現(xiàn)先天性遺傳疾病的在體基因治療。

DNA水平基因修復(fù)成為下一代基因治療新方向

基因治療是治療由基因突變引起的遺傳病的金鑰匙。目前，大多數(shù)工作都集中在mRNA的基因替換或基因沉默上。一些適用性較好的靶基因已經(jīng)應(yīng)用于臨床，顯示了基因治療的可行性。但就中心法則而言，mRNA水平的修復(fù)仍是治標(biāo)不治本，因此針對(duì)DNA的基因修復(fù)代表了下一代基因治療的新方向。本研究提出了專門針對(duì)DNA移碼突變的方案，系統(tǒng)論證了耳蝸毛細(xì)胞DNA水平的基因編輯可以有效恢復(fù)動(dòng)物聽力。

以CRISPR-Cas為代表的基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA層面的基因修復(fù)。隨著2011年CRISPR-Cas工具的發(fā)展和成熟，研究人員可以依賴guide  RNA（gRNA）。

實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定可控的定點(diǎn)DNA雙鏈切割/斷裂（DSB），CRISPR-Cas技術(shù)的一個(gè)重要應(yīng)用就是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切除致病突變。DSB的修復(fù)有諸多通路，其中最主要的是NHEJ和同源重組修復(fù)（HDR）兩種：NHEJ產(chǎn)物攜帶各種插入或者缺失（InDel）導(dǎo)致的移碼突變，其結(jié)果等同于從一個(gè)突變到多種突變，因此沒有得到基因治療的很好應(yīng)用；依賴HDR修復(fù)通路將靶基因修復(fù)為野生型，但是這一過程需要有一個(gè)野生型的DNA模板，然而在體情況下基于HDR通路的修復(fù)效率在活體動(dòng)物的終端分化細(xì)胞上效率非常低，從一定程度上限制了基因編輯在基因治療上的應(yīng)用。因此基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療方案一直處于實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞系體系研究階段。

首次在哺乳動(dòng)物模型上展示了利用NHEJ基因修復(fù)通路實(shí)現(xiàn)先天性遺傳疾病的在體基因治療

自2016年以來，陸續(xù)有基于細(xì)胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割產(chǎn)生的DSB的末端連接產(chǎn)物并非隨機(jī)，而是可以預(yù)測(cè)和重復(fù)實(shí)現(xiàn)的，那么基于這一原理，對(duì)于某一個(gè)gRNA所獲得DNA編輯事件可以預(yù)測(cè)，反過來說可以根據(jù)DNA產(chǎn)物需要來選擇gRNA。然而這一規(guī)律在體內(nèi)的實(shí)際情況是怎么樣的并不知道，該研究即利用小鼠耳蝸培養(yǎng)組織驗(yàn)證了終端分化的功能細(xì)胞上編輯產(chǎn)物也具有可重復(fù)性，并利用該原理實(shí)現(xiàn)了單個(gè)gRNA即可修復(fù)移碼突變，實(shí)現(xiàn)小鼠的在體基因治療。

本研究展示了接收聲音振動(dòng)的聽覺毛細(xì)胞可以利用內(nèi)源性DNA修復(fù)通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修復(fù)InDel導(dǎo)致的移碼突變，在遺傳性耳聾動(dòng)物模型（Pcdh15av-3j小鼠，攜帶一個(gè)腺苷的插入突變）上實(shí)現(xiàn)了導(dǎo)入單個(gè)gRNA有效修復(fù)該插入導(dǎo)致的遺傳性耳聾，而PCDH15蛋白是毛細(xì)胞tip link的組分，是毛細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通道開放的關(guān)鍵蛋白，蛋白質(zhì)量有215kD之巨。該概念的成功驗(yàn)證提示占人類22%的移碼突變導(dǎo)致的遺傳性疾病有廣闊的治療前景。

從體外組織和在體動(dòng)物兩個(gè)層面展示通過NHEJ通路實(shí)現(xiàn)移碼突變的修復(fù)以及聽覺和平衡覺功能的部分修復(fù)

熊巍實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期研究耳聾相關(guān)基因的生理和病理機(jī)制，本工作利用一株模擬人類DFNB23遺傳性耳聾的Pcdh15av-3j小鼠品系，全方位系統(tǒng)的展示了突變位點(diǎn)附近產(chǎn)生的DSB可以通過NHEJ通路實(shí)現(xiàn)移碼突變的修復(fù)以及聽覺和平衡覺功能的部分修復(fù)。本研究在體外組織和在體動(dòng)物兩個(gè)層面，從編輯基因產(chǎn)物、蛋白表達(dá)、毛細(xì)胞功能、以及動(dòng)物生理功能等多個(gè)角度的分析和評(píng)估來展現(xiàn)該方案的可行性。

組織層面：

耳蝸毛細(xì)胞的基因遞送一直是一個(gè)難點(diǎn)，熊巍博士早前開發(fā)了一套耳蝸組織培養(yǎng)和基因電轉(zhuǎn)遞送的系統(tǒng)解決方案（Xiong et al.,Nat. Protoc.2014），實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)的耳蝸組織上通過電轉(zhuǎn)（較大規(guī)模）向毛細(xì)胞導(dǎo)入外源基因，后續(xù)通過電生理或者鈣成像研究特定基因干預(yù)后的毛細(xì)胞功能變化?；谠摱侂娹D(zhuǎn)技術(shù)，熊巍實(shí)驗(yàn)室首先掃描了av-3j突變（1bp插入）上下游15bp的區(qū)域內(nèi)的4條gRNA所產(chǎn)生的編輯產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其中的m-3j-gRNA1表現(xiàn)出高比例的1bp刪除的編輯產(chǎn)物，而且重復(fù)性很高，意味著m-3j-gRNA1是一個(gè)潛在的治療av-3j突變的備選gRNA。在培養(yǎng)的Pcdh15av-3j耳蝸組織上，通過電轉(zhuǎn)表達(dá)了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15av-3j毛細(xì)胞可以恢復(fù)PCDH15蛋白的表達(dá)（Pcdh15av-3j突變導(dǎo)致PCDH15不表達(dá)上膜），同時(shí)Pcdh15av-3j毛細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)功能也有所恢復(fù)。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在內(nèi)的回碼（frame-restored）產(chǎn)物類別中，其最高占比產(chǎn)物均對(duì)PCDH15功能有明顯恢復(fù)，提示蛋白修復(fù)產(chǎn)物在非保守區(qū)即使1-2氨基酸的插入或者刪除并非絕對(duì)無功能，從轉(zhuǎn)化角度考慮也是值得去開發(fā)的一種可能性。

在體層面：

根據(jù)體外研究的效果，熊巍實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步對(duì)Pcdh15av-3j小鼠在體耳蝸注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。通過對(duì)電轉(zhuǎn)耳蝸組織（體外）和病毒注射耳蝸組織（在體）的基因編輯產(chǎn)物進(jìn)行的系統(tǒng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們無論是在主編輯產(chǎn)物還是產(chǎn)物的比例上均非常一致。進(jìn)一步的對(duì)m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指標(biāo)的評(píng)估，包括耳蝸毛細(xì)胞的PCDH15表達(dá)（蛋白表達(dá)）、耳蝸毛細(xì)胞的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)電流（細(xì)胞功能）、小鼠的聽性腦干電位（ABR，聽覺生理）和驚嚇反應(yīng)（Startle，行為學(xué)）等，均顯示單個(gè)m-3j-gRNA1在spCas9的幫助下即可實(shí)現(xiàn)av3j突變的功能性恢復(fù)。熊巍實(shí)驗(yàn)室同時(shí)也檢驗(yàn)了前庭器官的恢復(fù)效果，結(jié)果顯示Pcdh15av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢復(fù)。

為基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療提供進(jìn)一步支持

基因藥是繼化學(xué)藥之后的基礎(chǔ)和臨床各機(jī)構(gòu)研發(fā)的下一代藥物的重點(diǎn)方向，在人體基因遞送和基因表達(dá)等技術(shù)門檻陸續(xù)解決的情況下，遺傳性疾病的基因治療的前景越來越明確。2012年CRISPR-Cas技術(shù)的橫空出世，提供了有效且實(shí)用的DNA編輯工具，讓面向DNA的在體基因治療成為可能?；瘜W(xué)藥和基因替代/沉默等手段通常只能做到治標(biāo)不治本，而面向DNA的基因編輯帶來的基因修復(fù)，可以讓被修復(fù)基因跟隨生命體的生長(zhǎng)節(jié)奏在時(shí)間上和空間上實(shí)現(xiàn)內(nèi)源表達(dá)調(diào)控，是最自然的基因表達(dá)和調(diào)控的體現(xiàn)，也應(yīng)該是最理想的針對(duì)遺傳性疾病的修復(fù)方式。